ELISA法是免疫診斷中的一項新技術(shù)，現已成功地應用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲(chóng)病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經(jīng)使用的結果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡(jiǎn)單、快速、穩定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標本的檢查，而且由于一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本,因此，也適合于血清流行病學(xué)調查。本法不僅可以用來(lái)測定抗ti，而且也可用于測定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學(xué)各域的應用范圍日益擴大，

組成結構

1、血清：操作過(guò)程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內du素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅細胞迅速小心地分離。

2、2、血漿：EDTA、檸檬suan鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、細胞上清液：1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。

5、保存：如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70℃保存，避免反復冷凍。盡可能的不要使用溶血。如果血清中大量顆粒，檢測先離心或過(guò)濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

操作步驟：

1、使用，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2、根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個(gè)標準品和空白孔建議做復孔。每個(gè)樣品根據自己的數量來(lái)定，能使用復孔的盡量做復孔。

3、加入稀釋好后的標準品50ul于反應孔、加入待測樣品50ul于反應孔內。立即加入50ul標記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育45分鐘。

4、甩去孔內液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

5、每孔加入100ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6、甩去孔內液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復此操作4次。如果用洗板機洗滌，洗滌次數增加一次。

7、每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。

8、取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應立即測定結果。

9、在450nm波長(cháng)處測定各孔的OD值。

操作注意事項：

1、試劑應按標簽說(shuō)明書(shū)儲存，使用恢復到室溫。稀稀過(guò)后的標準品應丟棄，不可保存

2、實(shí)驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

3、不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)使用。

4、使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5、使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6、底物A應揮發(fā)，避免長(cháng)時(shí)間打開(kāi)蓋子。底物B對光敏感，避免長(cháng)時(shí)間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗完成后應立即讀取OD值。

7、加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時(shí)間一樣。按照說(shuō)明書(shū)中標明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

一般來(lái)講，96T能檢測90個(gè)樣本，48T能檢測42個(gè)樣本，這里面需要用標樣來(lái)做標準曲線(xiàn)，所以各位需要做實(shí)驗的老師們，請在購買(mǎi)ELISA試劑盒的時(shí)候注意，需要做多少個(gè)樣本，在決定買(mǎi)多大規格的試劑盒，以免做實(shí)驗時(shí)出現試劑盒不夠用或者浪費！
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